超靈敏電化學發光免疫分析技術 Electrochemiluminescence (ECL)_LRRK2 (PD)

帕金森氏症關鍵蛋白質LRRK2致病機制!!

根據先前研究，Leucine-rich-repeat kinase 2 (LRRK2)蛋白質的變異在遺傳性帕金森氏症中扮演關鍵角色；LRRK2蛋白質屬於ROCO protein family的一員，包括與受體的結合、磷酸激酶，以及GTP酶等功能，其中GTP酶的活性與LRRK2的單體及雙聚體的平衡息息相關，至於如何調控單體和雙聚體的機制則尚未清楚；但最近比利時布魯塞爾自由大學的研究團隊提出了一個可能的調控機制，發表在Nature Communications期刊，此調控機致大致如下:


當GTP結合LRRK2雙聚體時，會造成雙聚體結構改變趨向單體化而進行GTP的水解成GDP，然而GDP會再驅使單體LRRK2形成雙聚體，造成一個單體-雙聚體的循環；若LRRK2發生突變，導致雙聚體更穩定，雙聚體的單體化會受到影響，而降低GTP水解速度，因此對遺傳性帕金森氏症造成影響。超靈敏電化學發光免疫分析技術 Electrochemiluminescence (ECL)平台，最近發表了R-PLEX Human LRRK2 及LRRK2 pS935 antibody set，搭配U-PLEX提供一個高靈敏度與寬偵測範圍的分析平台。

                            R-PLEX Human LRRK2 Antibody Set Calibration Curve

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資料來源:  Meso Scale Discovery 原廠網站
                  第三代免疫分析技術 殷彥
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超靈敏電化學發光免疫分析技術 Electrochemiluminescence (ECL)

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次世代免疫分析技術 概論: 電化學發光  (Electrochemiluminescence )  是繼放射免疫、酵素免疫、螢光免疫、化學發光免疫測定之後的新一代標記免疫測定技術。電化學發光法源於電化學法和化學發光法，是一種在電極表面由電化學引發的特異性化學發光反應，包括了電化學和化學發光二個過程。電化學發光  (Electrochemiluminescence )  可以應用於所有的免疫測定，電化學發光能取代第一代放射免疫的靈敏度，又繼承了第二代酵素結合免疫吸附的通量方便，因而廣泛被全球大量藥廠及CRO公司所認可和使用，從此被載入了免疫分析技術發展的歷史中。 電化學發光原理: 包含: 電化學反應過程、化學發光過程及迴圈放大過程 電化學反應過程：在工作電極上 ( 陽極 ) 施加一定的電壓能量作用下，二價的三氯聯吡啶釕  [Ru(bpy)3]2+  釋放電子發生氧化反應而成為三價的三氯聯吡啶釕  [Ru(bpy)  3  ]  3+   ，同時，電極表面的 TPA 也釋放電子發生氧化反應而成為陽離子自由基  TPA+  ，並迅速自發脫去一個質子而形成三丙胺自由基  TPA· ，這樣，在反應體系中就存在具有強氧化性的三價的三氯聯吡啶釕  [Ru(bpy)  3  ]  3+   和具有強還原性的三丙胺自由基  TPA· 。 化學發光過程：具有強氧化性的三價的三氯聯吡啶釕  [Ru(bpy)  3  ]  3+   和具有強還原性的三丙胺自由基  TPA·  發生氧化還原反應，結果使三價的三氯聯吡啶釕  [Ru(bpy)3]3+  還原成激發態的二價的三氯聯吡啶釕  [Ru(bpy)  3  ] 2+   ，其能量來源於三價的三氯聯吡啶釕  [Ru(bpy)  3  ]  3+   與三丙胺自由基  TPA·  之間的電勢差，激發態  [Ru(bpy)  3  ]  2+   以螢光機制衰變並以釋放出一個波長為  620nm  光子的方式釋放能量，而成為基態的  [Ru(bpy) 3  ]  2+   。 迴圈放大過程：上述化學發光過程後，反應體系中仍存在二價的三氯聯吡啶釕  [Ru(bpy)  3  ]  2+   和三丙胺 (TPA) ，使得電極表面的電化學反應和化學發光過程可以繼續進行，這樣，整個反應過程可以迴圈進行。 通過上述的迴
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石墨電極微孔盤（ MSD 獨家專利）可包覆：懸浮細胞、貼壁細胞、抗體、蛋白質、多肽、病毒顆粒及細胞膜類似物等。 可應用於： (1)  生物標誌物偵測（細胞因子、分泌型蛋白質與細胞內磷酸化蛋白質） (2)  生物藥藥物代謝與免疫原性 (3)  生物藥物的高通量篩選 :  Cell Based Assay 、 Epitope Binning Assays 、 solution       equilibrium  kinetic exclusion KD measurement (MSD-SET) (4)  生物藥物品質管控： Lingand binding Assay 、  CHO 宿主細胞殘留、生物活性 (5)  小分子藥物的高通量篩選： Cell Based Assay (6)  疫苗的血清學免疫原性檢測：自行開發多因子檢測，單個樣品同時檢測 10 種免疫原性，節        約 80% 的時間。 (7)  自身抗體檢測：過敏、病毒與中和抗體 … 等。 MSD  多重偵測矩陣石墨電極微孔盤設計 在一個微孔內有不同的多重偵測矩陣，且有 96 孔及 384 孔石墨電極微孔盤可供選擇。 MSD 提供 2 種不同表面材質 石墨電極微孔盤 微孔盤 : Standard Plate:  疏水性材質 High Bind Plate:  親水性材質 微盤工作電極尺寸和表面材質決定了生物物質可包覆量的多寡: 石墨電極微孔盤包覆固定流程 : 由於微孔盤特殊石墨表面，可包覆 懸浮細胞、貼壁細胞、抗體、蛋白質、多肽、病毒顆粒及細胞膜類似物 … 等斗可直接包覆固定在高結合能力的微孔盤上。包覆固定流程，如下 : (1) Solution Coating:  和傳統 ELISA 包覆流程類似 (2) Spot Coating:  只將生物物質包付固定於工作電極上，大幅降低包覆使用體積 資資料來源:  Meso Scale Discovery 原廠網站                        第三代免疫分析技術 殷彥                        騰達行企業股份有限公司
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超靈敏電化學發光免疫分析技術 Electrochemiluminescence (ECL)_PD1_LAG3_MG

PD-1 和 LAG-3 雙特異抗體 Bioassay 日前 MacroGenics 公司宣佈該公司開發的兩款新藥的臨床開發進展；名為 MGD013 的新藥能夠同時靶向免疫檢查點 PD-1 和 LAG-3 ，目前第一名患者開始接受 MGD013 治療。  MGD013 能夠同時與表達在 T 淋巴細胞表面的免疫檢查點分子 PD-1 和 LAG-3 相結合。 MGD013 在血清中的半衰期很長，通過同時阻斷這兩個免疫檢查點分子的免疫抑制，它具有治療多種不同癌症的潛力。今年早些時候 MacroGenics 公司已經為 MGD013 向 FDA 遞交了 IND 申請。 文中( US 20170137517 A1) 介紹了 PD-1 和 LAG-3 雙特異性抗體的分析方法： SEB Activated Human PBMC Assay ,  Mixed Lymphocyte Reaction (MLR) Assay,  Engineered Bispecific Jurkat.hPD-1.LAG-3 Bioassay ，其中均使用了 MSD超靈敏電化學發光免疫分析技術 。 資料來源 :  Meso Scale Discovery  原廠網站                    第三代免疫分析技術   殷彥                    騰達行企業股份有限公司
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超靈敏電化學發光免疫分析技術 Electrochemiluminescence (ECL)_R U ready?

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可DIY專屬於你的多因子偵測試劑組!! 生命科學的研究越來越多樣性越複雜，需要同時觀察、偵測和分析許多不同的生物標誌物彼此消長與影響；市面上的產品漸漸的不符合需求，所以可客製化的多因子偵測平台變成一種新的趨勢。MSD超靈敏電化學發光免疫分析技術平台，因此，提供了可完全客製化的U-plex產品線，最近更開發了方便使用者作實驗的R-Plex antibody parie產品，讓使用者可以搭配已商業化的生物標誌產品，加上創新的客製化生物指標，得到高靈敏、可信賴且獨一無二的數據。 U-PLEX: 1. 快速輕鬆地設計和構建客製化的多因子試劑組 2. 從預選配置並使用自己的抗體或選擇已商業化抗體產品 3. 簡單實驗流程，流程類似於 ELISA; 無需額外晶片點樣機器 4. 相容所有 MSD 儀器（ S600 ， Quickplex SQ 120 等）和軟體 5. 開放平臺 : 相容抗體、蛋白質、多肽、碳水化合物、核酸、寡核苷酸 6. 優秀的 MSD 技術性能 : 高靈敏度、穩定的再現性 , 和寬廣的動態範圍 R-PLEX:  1.    市場上唯一經過血清、血漿測試驗證的抗體對產品，無需擔心血清 / 血漿基質效應干擾 2.    經過單因子驗證，使用者也可配套 U-plex 多因子試劑組使用 3.    擁有了 MSD 多因子檢測的高靈敏度與寬線性範圍特點 4.    研究領域涉及：發炎、癌症、免疫、代謝、肥胖、細胞信號傳遞與神經退行性疾病 資料來源 :  Meso Scale Discovery  原廠網站                    第三代免疫分析技術   殷彥                    騰達行企業股份有限公司
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超靈敏電化學發光免疫分析技術 Electrochemiluminescence (ECL)_Immunogenicity

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免疫原性 (Immunogenicity of Therapeutic Protein Product) 何謂免疫原性 ? 這裡指的是根據美國食品藥物管理局 (FDA) 於 2014 年 8 月所頒布之治療型蛋白質藥物產品免疫原性評估指引 (Guidancefor Industry: Immunogenicity Assessment for Therapeutic Protein Products) 所定義之治療型蛋白質藥物活性成分或其所含相關蛋白質引發的不良免疫反應，包括 : 過敏反應 (anaphylaxis) 、細胞激素釋放症狀 (cytokine release syndrome) 、原生性蛋白質交叉中和反應 (cross-reactive neutralization of endogenous protein mediating critical functions)… 等，均會影響病人的用藥安全及藥品療效，所以蛋白質藥物在上市前的研發過程中，除了對特定疾病的療效外，也不須同時評估免疫原性的影響，以降低蛋白質藥物使用上的風險。因此，除了美國食品藥物管理局外，世界衛生組織 (WHO) 、歐洲藥物管理局 (EMA) 也皆有相關指引及規範。 治療型蛋白質藥物產品免疫原性評估，大致可分為四個步驟 : 1. 抗治療型蛋白質藥物抗體 (Anti-drug antibody ； ADA) 偵測篩選 2. 抗治療型蛋白質藥物抗體驗證 (Confirmatory ADA assay) 3. 特性分析 (Characterization assay) 4. 中和性抗治療型蛋白質藥物抗體鑑定 (Neutralizing antibody assay) 簡而言之，免疫原性評估即針對治療型蛋白質藥物因免疫反應產生的抗治療型蛋白質藥物抗體 (ADA) 進行偵測、驗證、特性分析及鑑定；所產生的抗治療型蛋白質藥物抗體中，又以會中和治療型蛋白質藥物功能的中和性抗治療型蛋白質藥物抗體最為關鍵。 目前免疫原性評估方法學中，有幾個嚴峻的挑戰，如 : 抗治療型蛋白質藥物抗體偵測靈敏度、基質效應及血藥兼容性 (Drug tolerance) ；以偵測靈敏度來說，美國食品藥物管理局在 2014 的評估指引中建議靈敏度至少需達 250 –
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超靈敏電化學發光免疫分析技術 Electrochemiluminescence (ECL)_PD1_SF

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Sanofi ：小鼠腫瘤模型的 PD-1 抗體濃度與 PBMC 細胞因子風暴 REGN2810 是由美國傑納隆藥廠 (Regeneron) 和賽諾菲 (Sanofi) 聯合開發的一款針對 PD-1 的免疫檢查點抑制劑藥物。 目前，關於 REGN2810 的臨床試驗共有 8 項，其中在轉移性非小細胞肺癌中的與鉑化療對比的研究已經進行到 3 期。在 2017 年美國臨床腫瘤學會（ ASCO ， American Society of Clinical Oncology ）年會上， 傑納隆藥廠 和賽諾菲發佈了關於 REGN2810 臨床試驗結果的口頭報告（ Abstract #9503 ），發表了針對晚期皮膚鱗狀細胞癌患者的 1 期劑量爬坡試驗結果（ NCT02383212 ）。本次試驗中，客觀緩解率（ ORR ， overall response rate ）達到了 46.2% ，在 26 例病人中，共有 2 例完全緩解， 9 例部分緩解， 1 例未經證實的部分緩解。疾病控制率（ DCRR ， disease control rate ）更是達到了 69.2% ，其中包含 12 例的客觀緩解和 6 例疾病穩定。在此次資料披露中，由於還未達到無進展生存期和總生存期的資料披露截止日期，所以還未得知 PFS 和 OS 。但值得注意的是，有 10 位元患者在資料統計截止時，仍然保持著對藥物的反應。 Sanofi 在 PD-1 藥物研究中，使用 MSD超靈敏 電化學發光免疫分析技術 偵測 PBMC 細胞因子與小鼠腫瘤動物模型的 PD-1 抗體濃度。   Cytokine release following human PBMC exposure to immobilized REGN2810,REGN2329 (TGN1412) and anti-CD3 (OKT3) antibodies.  原文聯結 資料來源 :  Meso Scale Discovery  原廠網站                    第三代免疫分析技術   殷彥                    騰達行企業股份有限公司
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超靈敏電化學發光免疫分析技術 Electrochemiluminescence (ECL)_LBA

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21 世紀Ligand Binding Assay平台的要求與選擇!! Pfizer、 Amgen、 Biogen、 Celgene 和Genentech...等知名大藥廠於2012年聯合發表了一篇名為:Ligand Binding Assays in the 21st Century Laboratory: Platforms的文章，內容說明了目前各大藥廠對理想Ligand Binding Assay平台實際操作的要求，特別針對靈敏度、偵測範圍、精準度、耐用性、實驗所需時間、多重偵測能力、靈活性和通量、樣品多樣性及產品支援服務...等項目進行全面的評估，最後，MSD超靈敏電化學發光免疫分析技術平台通過這些嚴苛要求，符合理想Ligand Binding Assay的平台，為蛋白質藥物開發的一項利器。 原文連結 資料來源 :   Meso Scale Discovery  原廠網站                    第三代免疫分析技術   殷彥                    騰達行企業股份有限公司
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