超靈敏電化學發光免疫分析技術 Electrochemiluminescence (ECL)_LBA

21 世紀Ligand Binding Assay平台的要求與選擇!!

Pfizer、 Amgen、 Biogen、 Celgene 和Genentech...等知名大藥廠於2012年聯合發表了一篇名為:Ligand Binding Assays in the 21st Century Laboratory: Platforms的文章，內容說明了目前各大藥廠對理想Ligand Binding Assay平台實際操作的要求，特別針對靈敏度、偵測範圍、精準度、耐用性、實驗所需時間、多重偵測能力、靈活性和通量、樣品多樣性及產品支援服務...等項目進行全面的評估，最後，MSD超靈敏電化學發光免疫分析技術平台通過這些嚴苛要求，符合理想Ligand Binding Assay的平台，為蛋白質藥物開發的一項利器。



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資料來源:  Meso Scale Discovery 原廠網站
                  第三代免疫分析技術 殷彥
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超靈敏電化學發光免疫分析技術 Electrochemiluminescence (ECL)

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次世代免疫分析技術 概論: 電化學發光  (Electrochemiluminescence )  是繼放射免疫、酵素免疫、螢光免疫、化學發光免疫測定之後的新一代標記免疫測定技術。電化學發光法源於電化學法和化學發光法，是一種在電極表面由電化學引發的特異性化學發光反應，包括了電化學和化學發光二個過程。電化學發光  (Electrochemiluminescence )  可以應用於所有的免疫測定，電化學發光能取代第一代放射免疫的靈敏度，又繼承了第二代酵素結合免疫吸附的通量方便，因而廣泛被全球大量藥廠及CRO公司所認可和使用，從此被載入了免疫分析技術發展的歷史中。 電化學發光原理: 包含: 電化學反應過程、化學發光過程及迴圈放大過程 電化學反應過程：在工作電極上 ( 陽極 ) 施加一定的電壓能量作用下，二價的三氯聯吡啶釕  [Ru(bpy)3]2+  釋放電子發生氧化反應而成為三價的三氯聯吡啶釕  [Ru(bpy)  3  ]  3+   ，同時，電極表面的 TPA 也釋放電子發生氧化反應而成為陽離子自由基  TPA+  ，並迅速自發脫去一個質子而形成三丙胺自由基  TPA· ，這樣，在反應體系中就存在具有強氧化性的三價的三氯聯吡啶釕  [Ru(bpy)  3  ]  3+   和具有強還原性的三丙胺自由基  TPA· 。 化學發光過程：具有強氧化性的三價的三氯聯吡啶釕  [Ru(bpy)  3  ]  3+   和具有強還原性的三丙胺自由基  TPA·  發生氧化還原反應，結果使三價的三氯聯吡啶釕  [Ru(bpy)3]3+  還原成激發態的二價的三氯聯吡啶釕  [Ru(bpy)  3  ] 2+   ，其能量來源於三價的三氯聯吡啶釕  [Ru(bpy)  3  ]  3+   與三丙胺自由基  TPA·  之間的電勢差，激發態  [Ru(bpy)  3  ]  2+   以螢光機制衰變並以釋放出一個波長為  620nm  光子的方式釋放能量，而成為基態的  [Ru(bpy) 3  ]  2+   。 迴圈放大過程：上述化學發光過程後，反應體系中仍存在二價的三氯聯吡啶釕  [Ru(bpy)  3  ]  2+   和三丙胺 (TPA) ，使得電極表面的電化學反應和化學發光過程可以繼續進行，這樣，整個反應過程可以迴圈進行。 通過上述的迴
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超靈敏電化學發光免疫分析技術 Electrochemiluminescence (ECL)_組織均質液樣品

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組織勻質液樣品，如使用 Western Blot 、 ELISA 容易出現以下問題： （ 1 ）樣本用量較大，珍貴樣品用量不足。 （ 2 ） 樣品基質複雜，容易導致實驗結果差異大；尤其是 WB 再現性差， CV 差異遠大於           20% ，往往要做一份樣品要測 3 重複。 （ 3 ）一些高含量的蛋白質，超過 WB/ELISA 偵測上限，訊號過強，需要重新測試實驗條件。 （ 4 ）一些低含量的蛋白質，低於 WB/ELISA 偵測下限，檢測不到，無計可施。 （ 5 ） WB 時間長，步驟多，常見問題和常見解決方案多，遇到問題，解決起來繁瑣耗時。 相對的，若使用MSD 超靈敏電化學發光免疫分析技術 系統可克服上述 問題： （ 1 ） 10 - 20% 的樣品用量。 （ 2 ） CV 在 20%  以內，一份樣品重複 2 次，或者不重複也可。 （ 3 ） MSD （ Meso Scale Discovery ）偵測範圍廣，容易一次性檢測出不同含量的蛋白質。 （ 5 ）多篇 SCI 文獻報導 MSD （ Meso Scale Discovery ）和 WB 的資料趨勢一致，而且有           更高的樣品檢出率。 （ 6 ） AKT, MAPK,  細胞凋亡， EGFR  等訊息傳導可使用一個試劑盒檢測。 ( 點擊連 結，可查看試劑組清 單） （ 7 ） 組織勻質液樣品的處理， MSD 建議如下： Tissue Homogenates with MSD Assays This is a very general protocol for tissue homogenates that has worked well on ourplatform. The tissue pulverization technique described below is a sonicator butyou can use a tissue grinder or an alternate tool.  Some scientists use MSD lysis buffer to generate homogenates while others have their own
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超靈敏電化學發光免疫分析技術 Electrochemiluminescence (ECL)_Normal Sample Test

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MSD V-Plex 正常檢體樣品檢出率!! 在所有多重因子偵測平台中，面對一個很大的挑戰---正常檢體檢出率；一個常見的實驗設計裡，通常包含了實驗組(特定疾病檢體)及對照組(正常檢體)，利用多重因子偵測平台偵測分析，探討兩組數據之間的差別，但由於正常檢體的目標蛋白質濃度通常偏低，導致低於偵測平台的偵測極限，影響實驗結果。有鑒於此，MSD超靈敏電化學發光免疫分析技術在V-Plex的試劑組說明書中均載明了在正常檢體不同目標蛋白質的檢測範圍及檢出率，甚至提供了不同檢體類型的數據，讓使用者可以選擇最符合經濟效益、最適合自己實驗設計的客製化試劑組合，解決正常檢體檢出率的問題。 資料來源 :   Meso Scale Discovery  原廠網站                    第三代免疫分析技術   殷彥                    騰達行企業股份有限公司
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超靈敏電化學發光免疫分析技術 Electrochemiluminescence (ECL)_AD

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檢測阿茲海默症 ：PET，質譜，MSD，選擇哪一個？JAMA最新發現 阿茲海默病 (alzheimer's disease ； AD) 是最常見的老年失智症，占所有老年失智患者的 50 ％ o ～ 70 ％，是以記憶和其他高級認知功能下降為特徵的大腦退化性疾病，具有高發病率、高患病率和高致殘率的特點，發病率僅次於心血管病和癌症，據統計顯示 2030 年全世界阿茲海默病患者將達 6300 萬人，我國阿茲海默病患者人數將超過 40 萬。由於阿茲海默病患者的中晚期治療效果不佳，因此臨床早期診斷尤為重要 .2011 年美國國家衰老研究所和阿茲海默病學會發表的最新阿茲海默病診斷指南，將其視為包括輕度認知功能障礙 (MCI) 在內的連續疾病過程，並將生物標誌納入診斷標準。生物標記物與阿茲海默病病理診斷標準的關聯非常重要 , 研究表明阿茲海默病主要的病理學特徵有出現澱粉樣斑塊 [ 包括 β 澱粉樣蛋白質 (Aβ)] 、神經原纖維纏結和神經遞質系統的神經元減少。以往 Aβ 沉積只能通過腦組織活檢或屍體解剖進行病理診斷，近年來隨著正電子斷層成像 (PET) Aβ 顯影劑的研製，使阿茲海默病的早期診斷成為可能。 PET  是一種向生物體內部注入正電子同位素標記的化合物，體外測量它們的空間分佈和時間特性的三維成像技術，它是目前核醫學成像的最新發展。隨著高靈敏度蛋白質標誌物的免疫分析檢測技術發展，通過檢測腦脊液的 Aβ 、 Tau 等蛋白質也可鑑定早期阿茲海默病。在瑞典的一項研究中，比較了正電子發射斷層成像 (PET) 與腦脊液標誌物 Aβ42 的相關性。並在檢測腦脊液 Aβ42 的技術平臺上比較了 MSD 、質譜等不同技術。結論顯示： MSD 超靈敏電化學發光免疫分析技術檢測腦脊液 Aβ42 與 PET 相關性很好，質譜與 PET 相關性相對較差。該文發表在神經科學頂級刊物 JAMA NEUROLOGY 。 Separation of populations with  positive and negative PET findings  used cutoffs for cerebrospinal fluid  (CSF) levels of β-amyloid (Aβ) 42 and  Aβ42 to  phosphorylated tau (P
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超靈敏電化學發光免疫分析技術 Electrochemiluminescence (ECL)_Plate Technology

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石墨電極微孔盤（ MSD 獨家專利）可包覆：懸浮細胞、貼壁細胞、抗體、蛋白質、多肽、病毒顆粒及細胞膜類似物等。 可應用於： (1)  生物標誌物偵測（細胞因子、分泌型蛋白質與細胞內磷酸化蛋白質） (2)  生物藥藥物代謝與免疫原性 (3)  生物藥物的高通量篩選 :  Cell Based Assay 、 Epitope Binning Assays 、 solution       equilibrium  kinetic exclusion KD measurement (MSD-SET) (4)  生物藥物品質管控： Lingand binding Assay 、  CHO 宿主細胞殘留、生物活性 (5)  小分子藥物的高通量篩選： Cell Based Assay (6)  疫苗的血清學免疫原性檢測：自行開發多因子檢測，單個樣品同時檢測 10 種免疫原性，節        約 80% 的時間。 (7)  自身抗體檢測：過敏、病毒與中和抗體 … 等。 MSD  多重偵測矩陣石墨電極微孔盤設計 在一個微孔內有不同的多重偵測矩陣，且有 96 孔及 384 孔石墨電極微孔盤可供選擇。 MSD 提供 2 種不同表面材質 石墨電極微孔盤 微孔盤 : Standard Plate:  疏水性材質 High Bind Plate:  親水性材質 微盤工作電極尺寸和表面材質決定了生物物質可包覆量的多寡: 石墨電極微孔盤包覆固定流程 : 由於微孔盤特殊石墨表面，可包覆 懸浮細胞、貼壁細胞、抗體、蛋白質、多肽、病毒顆粒及細胞膜類似物 … 等斗可直接包覆固定在高結合能力的微孔盤上。包覆固定流程，如下 : (1) Solution Coating:  和傳統 ELISA 包覆流程類似 (2) Spot Coating:  只將生物物質包付固定於工作電極上，大幅降低包覆使用體積 資資料來源:  Meso Scale Discovery 原廠網站                        第三代免疫分析技術 殷彥                        騰達行企業股份有限公司
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超靈敏電化學發光免疫分析技術 Electrochemiluminescence (ECL)_PD1_LAG3_MG

PD-1 和 LAG-3 雙特異抗體 Bioassay 日前 MacroGenics 公司宣佈該公司開發的兩款新藥的臨床開發進展；名為 MGD013 的新藥能夠同時靶向免疫檢查點 PD-1 和 LAG-3 ，目前第一名患者開始接受 MGD013 治療。  MGD013 能夠同時與表達在 T 淋巴細胞表面的免疫檢查點分子 PD-1 和 LAG-3 相結合。 MGD013 在血清中的半衰期很長，通過同時阻斷這兩個免疫檢查點分子的免疫抑制，它具有治療多種不同癌症的潛力。今年早些時候 MacroGenics 公司已經為 MGD013 向 FDA 遞交了 IND 申請。 文中( US 20170137517 A1) 介紹了 PD-1 和 LAG-3 雙特異性抗體的分析方法： SEB Activated Human PBMC Assay ,  Mixed Lymphocyte Reaction (MLR) Assay,  Engineered Bispecific Jurkat.hPD-1.LAG-3 Bioassay ，其中均使用了 MSD超靈敏電化學發光免疫分析技術 。 資料來源 :  Meso Scale Discovery  原廠網站                    第三代免疫分析技術   殷彥                    騰達行企業股份有限公司
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超靈敏電化學發光免疫分析技術 Electrochemiluminescence (ECL)_R U ready?

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可DIY專屬於你的多因子偵測試劑組!! 生命科學的研究越來越多樣性越複雜，需要同時觀察、偵測和分析許多不同的生物標誌物彼此消長與影響；市面上的產品漸漸的不符合需求，所以可客製化的多因子偵測平台變成一種新的趨勢。MSD超靈敏電化學發光免疫分析技術平台，因此，提供了可完全客製化的U-plex產品線，最近更開發了方便使用者作實驗的R-Plex antibody parie產品，讓使用者可以搭配已商業化的生物標誌產品，加上創新的客製化生物指標，得到高靈敏、可信賴且獨一無二的數據。 U-PLEX: 1. 快速輕鬆地設計和構建客製化的多因子試劑組 2. 從預選配置並使用自己的抗體或選擇已商業化抗體產品 3. 簡單實驗流程，流程類似於 ELISA; 無需額外晶片點樣機器 4. 相容所有 MSD 儀器（ S600 ， Quickplex SQ 120 等）和軟體 5. 開放平臺 : 相容抗體、蛋白質、多肽、碳水化合物、核酸、寡核苷酸 6. 優秀的 MSD 技術性能 : 高靈敏度、穩定的再現性 , 和寬廣的動態範圍 R-PLEX:  1.    市場上唯一經過血清、血漿測試驗證的抗體對產品，無需擔心血清 / 血漿基質效應干擾 2.    經過單因子驗證，使用者也可配套 U-plex 多因子試劑組使用 3.    擁有了 MSD 多因子檢測的高靈敏度與寬線性範圍特點 4.    研究領域涉及：發炎、癌症、免疫、代謝、肥胖、細胞信號傳遞與神經退行性疾病 資料來源 :  Meso Scale Discovery  原廠網站                    第三代免疫分析技術   殷彥                    騰達行企業股份有限公司
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超靈敏電化學發光免疫分析技術 Electrochemiluminescence (ECL)_Immunogenicity

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免疫原性 (Immunogenicity of Therapeutic Protein Product) 何謂免疫原性 ? 這裡指的是根據美國食品藥物管理局 (FDA) 於 2014 年 8 月所頒布之治療型蛋白質藥物產品免疫原性評估指引 (Guidancefor Industry: Immunogenicity Assessment for Therapeutic Protein Products) 所定義之治療型蛋白質藥物活性成分或其所含相關蛋白質引發的不良免疫反應，包括 : 過敏反應 (anaphylaxis) 、細胞激素釋放症狀 (cytokine release syndrome) 、原生性蛋白質交叉中和反應 (cross-reactive neutralization of endogenous protein mediating critical functions)… 等，均會影響病人的用藥安全及藥品療效，所以蛋白質藥物在上市前的研發過程中，除了對特定疾病的療效外，也不須同時評估免疫原性的影響，以降低蛋白質藥物使用上的風險。因此，除了美國食品藥物管理局外，世界衛生組織 (WHO) 、歐洲藥物管理局 (EMA) 也皆有相關指引及規範。 治療型蛋白質藥物產品免疫原性評估，大致可分為四個步驟 : 1. 抗治療型蛋白質藥物抗體 (Anti-drug antibody ； ADA) 偵測篩選 2. 抗治療型蛋白質藥物抗體驗證 (Confirmatory ADA assay) 3. 特性分析 (Characterization assay) 4. 中和性抗治療型蛋白質藥物抗體鑑定 (Neutralizing antibody assay) 簡而言之，免疫原性評估即針對治療型蛋白質藥物因免疫反應產生的抗治療型蛋白質藥物抗體 (ADA) 進行偵測、驗證、特性分析及鑑定；所產生的抗治療型蛋白質藥物抗體中，又以會中和治療型蛋白質藥物功能的中和性抗治療型蛋白質藥物抗體最為關鍵。 目前免疫原性評估方法學中，有幾個嚴峻的挑戰，如 : 抗治療型蛋白質藥物抗體偵測靈敏度、基質效應及血藥兼容性 (Drug tolerance) ；以偵測靈敏度來說，美國食品藥物管理局在 2014 的評估指引中建議靈敏度至少需達 250 –
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超靈敏電化學發光免疫分析技術 Electrochemiluminescence (ECL)_PD1_SF

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Sanofi ：小鼠腫瘤模型的 PD-1 抗體濃度與 PBMC 細胞因子風暴 REGN2810 是由美國傑納隆藥廠 (Regeneron) 和賽諾菲 (Sanofi) 聯合開發的一款針對 PD-1 的免疫檢查點抑制劑藥物。 目前，關於 REGN2810 的臨床試驗共有 8 項，其中在轉移性非小細胞肺癌中的與鉑化療對比的研究已經進行到 3 期。在 2017 年美國臨床腫瘤學會（ ASCO ， American Society of Clinical Oncology ）年會上， 傑納隆藥廠 和賽諾菲發佈了關於 REGN2810 臨床試驗結果的口頭報告（ Abstract #9503 ），發表了針對晚期皮膚鱗狀細胞癌患者的 1 期劑量爬坡試驗結果（ NCT02383212 ）。本次試驗中，客觀緩解率（ ORR ， overall response rate ）達到了 46.2% ，在 26 例病人中，共有 2 例完全緩解， 9 例部分緩解， 1 例未經證實的部分緩解。疾病控制率（ DCRR ， disease control rate ）更是達到了 69.2% ，其中包含 12 例的客觀緩解和 6 例疾病穩定。在此次資料披露中，由於還未達到無進展生存期和總生存期的資料披露截止日期，所以還未得知 PFS 和 OS 。但值得注意的是，有 10 位元患者在資料統計截止時，仍然保持著對藥物的反應。 Sanofi 在 PD-1 藥物研究中，使用 MSD超靈敏 電化學發光免疫分析技術 偵測 PBMC 細胞因子與小鼠腫瘤動物模型的 PD-1 抗體濃度。   Cytokine release following human PBMC exposure to immobilized REGN2810,REGN2329 (TGN1412) and anti-CD3 (OKT3) antibodies.  原文聯結 資料來源 :  Meso Scale Discovery  原廠網站                    第三代免疫分析技術   殷彥                    騰達行企業股份有限公司
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